上海交通大学|高博闻(上海交通大学）2017年博士论文
【背景】:
皮片移植术是广泛应用于整复外科领域的一项治疗技术。虽然相比皮瓣转移术,皮片移植术的过程更加简便,但是由于皮片移植到受区后,早期缺少血供,需经历再血管化的过程,因此存活后的皮片常有质地差和挛缩率高等问题。已有研究证实注射干细胞悬液在鼠皮片移植模型中可以通过增加其血管化来改善皮片的质地和挛缩。但在实际应用中,干细胞悬液在注射进入皮片和创面之间时,存在流动性过大而导致的局部干细胞流失问题。因此,寻找一种合适的细胞载体来避免这一问题的发生是十分必要的。富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)是能释放多种生长因子、具有促进干细胞增殖分化的生物来源细胞支架。脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)复合PRP已被证实能促进创面愈合以及组织再生。
ADSCs组织形态学观察(40×)图A：3d后即可在细胞培养瓶壁上观察到外形呈长梭形
图片上下文：
2次换液后长梭形的细胞集落基本完全融合。7~8d后将原代细胞进行传代，传代细胞在培养瓶中呈均匀分布，生长迅速，约3~4d即可铺满瓶壁，细胞多呈梭形，漩涡样生长(图1A-B)。图A 原代ADSCs 培养3天后图B 原代ADSCs 培养7天后图1 ADSCs组织形态学观察(40×) 图A：3d后即可在细胞培养瓶壁上观察到外形呈长梭形的细胞，集落样分布；图B：7d后将原代细胞呈均匀分布，互相融合铺满瓶壁
ADSCs成脂成骨诱导分化油红O及茜素红染色
图片上下文：
胞浆中出现折光性的圆形脂滴，细胞由原来的梭形变为圆形或多角形，2周后油红O染色见胞浆内脂滴被染成橙红色，即油红O成脂染色为阳性， 证实成功分化为脂肪细胞(图2A)。对照组常规培养，细胞内没有脂滴出现，油红O染色阴性。第3代细胞置于成骨诱导培养基分化3周细胞形态由长梭形变为短梭形、多边形等，茜素红染色可见有红色颗粒构成的小结节，提示有钙化结节形成， 即茜素红染色阳性，证实成功分化为成骨细胞(图2B )。对照组常规培养，未见细胞变形，茜素红染色阴性。图A： 油红O染色(40×)
【目的】:
应用复合ADSCs的PRP辅助大鼠背部皮片移植,检测移植的皮片质地以及血管化相关指标,以证实PRP联合ADSCs辅助皮片移植的有效性并探讨其相关机制,为临床应用提供参考和理论依据。
PRP扫描电镜结果显示三维结构中，由纵横交错的纤维素形成立体网状结构，空隙直径约1-5微米
图片上下文：
3.6 PRP激活和ADSCs种植PRP经过激活剂激活后5-10min就形成胶冻状。扫描电镜结果显示器凝胶三维结构中，由纵横交错的纤维素形成立体网状结构，空隙直径约1-5微米（图4A）。未激活RPR与ADSCs混合后取1.5ml置入六孔板激活，形成厚约1mm的薄层胶（图4B）。扫面电镜结果显示在纤维网中ADSCs附着良好(图4C-D)。A：PRP扫描电镜（3000×）
【方法】:
1、从Lewis大鼠脂肪组织中分离培养出脂肪干细胞,通过成脂和成骨诱导分化对干细胞相关特性进行鉴定。
将种植有ADSCs的PRP置于创面
图片上下文：
上海交通大学医学院博士学位论文24图5 将种植有ADSCs的PRP置于创面。回皮片移植片并打包，最后用石膏及纱布固定。2.2 主要观察指标2.2.1 皮片挛缩率每个皮片记录回植后即刻和 14 天，1 月和 3 月后的面积大小，并计算比值，即挛缩率。2.2.2 弹性模量皮片在 14 天，1 月和 3 月后取样。张力仪将自动记录随着张力增加时皮片的弹性形变程度并计算弹性模量。2.3 组织标本制备皮片在术后在14天，1月和3月后处死各组大鼠后取样，使用体积分数4%甲醛固定，脱梯度脱水、浸蜡、包埋后制成约5μm厚的切片
2、选取6~7周龄雄性Lewis大鼠经腹主动脉取血并制备PRP。将PRP进行血小板计数并通过ELISA技术检测体外释放VEGF,b FGF和PDGF-BB的含量。
3、将ADSCs种植于PRP后使PRP变为胶状备用。ADSCs种植于PRP的电镜分析。
4、建立大鼠背部皮片移植模型,大鼠背部取3*3厘米皮片,修剪至真皮浅层,原位覆盖创面并与周围皮肤缝合。将所有大鼠随机分成4组(每组18只),其中A组为空白组;B组为PRP处理组;C组为ADSCs处理组;D组为ADSCs+PRP处理组。记录术后第14、30、90天的皮片挛缩率、弹性模量、血流状况并进行统计分析。
各组皮片在两周、一月和三月后的弹性模量
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26一月和三月后的弹性模量。两周后 PRP+个月时，两组存在显著差异（p<0.05）。小皮片弹性模量模量为 2.8±1.5MPa。两周后，空白组.1 MPa；PRP 组为 4.9±1.5 MPa；PR0.05，与 B、C 组无统计学差异）。一月s 组为 3.9±1.9 MPa；PRP 组为 4.2±相比 A 组 p<0.05，与 B、C 组无统计.3 MPa；ADSCs 组为 9.3±4.0 MPa；PR2W 1M 3M
5、术后根据不同时间点取材进行石蜡切片,然后行组织HE染色、Masson染色和CD31、VEGF免疫组织化学染色,观察不同组别的移植皮片的结构差异、胶原生成及血管生成情况。
各组皮片在三月后的HE染色
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但是仍然小于 PRP+ADSCs 组（图8A-D）。PRP+ADSCs 组在三个月时比空白组表皮厚度增加 200%。0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2w 1m 3m Elasticity Modulus(MPa) control ADSCs PRP PRP+ADSCs
各组皮片在三月后的Masson染色
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图 C ADSCs 组 图 D PRP+ADSCs 组图 9 各组皮片在三月后的 Masson 染色。PRP+ADSCs 组皮下胶原比空白组含量丰富且排列更整齐。
6、术后根据不同时间点取材,利用RT-PCR技术、Western-blot技术检测各组之间血管化相关因子VEGF、b FGF和PDGF-BB的差异。
7、利用RT-PCR技术检测PI3K/AKT通路和PLCγ/MAPK通路激活情况。
【结果】:
1、从大鼠脂肪组织分离培养的ADSCs形态呈现为梭形,具有较强的自我更新和增殖能力,有向成脂和成骨方向分化潜能,生物学特性稳定。
2、大鼠PRP中血小板计数约为全血的6.19倍。PRP体外能持续释放血管化因子VEGF、PDGF-BB和b FGF。
3、电镜显示PRP多孔结构,ADSCs可均匀种植于PRP中并存活良好。PRP性状适用于涂抹于皮片和创面基底之间。
4、ADSCs组相比空白组三个月时挛缩率减少46.8%(p<0.005)、柔软度增加44%(p<0.005)、表皮厚度增加200%(p<0.005)、皮下胶原生成增加且排列更紧密。
5、激光多普勒血流信号和切片免疫组化结果显示ADSCs+PRP组皮片相比空白组在两周时开始有更多的血管生成。
血流检测结果显示PRP+ADSCs组在两周（A）和一月（C）均比空白组（B、D）血
图片上下文：
D：空白组一月后血流信号图 10 血流检测结果显示 PRP+ADSCs 组在两周（A）和一月（C）均比空白组（B、D）血流灌注充分3.1.2 VEGF 和 CD31 免疫组化结果免疫组化结果显示从术后两周起，PRP+ADSCs 组的皮下新生小血管的数量显著高于空白组（图 11A-D）。且 VEGF 在皮下的表达明显高于对照组（图 12A-D）。且。
PRP+ADSCs组相比空白组在两周时AKT（p<0.05）表达量高（图A）
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RP+ADSCs 组相比空白组在两周时 AKT（p<0.05）表达量高白组在两周时 MAPK（p<0.05）表达量高（图 B）。空白组 ADSCs组 PRP组 ADSCs+PRP组
6、通过RT-PCR四组之间血管化相关因子表达水平差异,结果显示随着皮片移植模型中使用ADSCs+PRP,皮片从第二周开始VEGF、PDGF-BB和b FGF分别是空白组的7.90倍(p<0.05)、3.00倍(p<0.05)和5.25倍(p<0.05),一个月时分别是7.00倍(p<0.01)、9.18倍(p<0.01)和5.00倍(p<0.01)。三个月时分别是22.17倍(p<0.005)、50.57倍(p<0.005)和5.80倍(p<0.01)。从Westernblot的结果中可以看出,随着皮片移植模型中使用ADSCs+PRP,皮片从第二周开始VEGF、PDGF-BB和b FGF分别是空白组的5.17倍(p<0.05)、2.65倍(p<0.05)和4.30倍(p<0.05),一个月时分别是1.15倍、8.66倍(p<0.05)和5.70倍(p<0.05)。三个月时分别是1.25倍(p<0.05)、1.99倍(p<0.05)和1.75倍(p<0.05)。
7、通过RT-PCR检测,ADSCs+PRP组AKT和MAPK表达分别为空白组1.5倍和2.32倍(p<0.05)。
【结论】
ADSCs复合PRP能通过使大鼠皮片组织血管化因子表达升高,并增加大鼠皮片中血管新生,从而使大鼠皮片质地改善。ADSCs复合PRP能使皮片血管化程度增加的其中原因之一是ADSCs复合PRP激活了PI3K/AKT信号通路和PLCγ/MAPK通路使内皮细胞发生行为学改变。ADSCs和PRP对增加皮片血管化而改善皮片移植效果有互相增强作用。
图11两周时PRP+ADSCs组每视野CD31阳性结果显著高于空白组（p<0.01）
图片上下文：
46图 D PRP+ADSCs 组图 11 两周时 PRP+ADSCs 组每视野 CD31 阳性结果显著高于空白组（p<0.0头所示为CD31阳性的新生血管。PRP组和ADSCs组新生血管小于PRP+ADSPRP 组和 ADSCs 组之间无明显差异。
图12两周时PRP+ADSCs组（图D）VEGF阳性结果显著高于空白组（图A）
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48图 D PRP+ADSCs 组图 12 两周时 PRP+ADSCs 组（图 D）VEGF 阳性结果显著高于空白组（图 AADSCs 组介于 A 和 D 之间。3.2 从基因水平检测 PRP+ADSCs 对皮片血管化因子表达情况VEGF 在两周时空白组平均 CT 值为 0.00391；ADSCs+PRP 组为 0.030空白组平均 CT 值为 0.0048；ADSCs+PRP 组为 0.0336。三月时，空白
领 域:
外科学；
关键词:
